如果用不同的標記物標記不同的核酸探針，只要互相不影響各自的雜交反應，檢測系統也不相互干擾，雜交信號易于分辨，原則上均能用于雙重或多重標記原位雜交。應用非放射性標記探針的雙重標記原位雜交。可克服放射性核素標記探針的分辨率低、時間長以及放射性污染等缺點。
1．應用生物素標記探針的雙重標記原位雜交 應用生物素分別標記的兩種探針進行雙重標記原位雜交時，雜交反應可用含兩種標記探針的雜交液一次進行。因為生物素標記探針可用辣根過氧化物酶標記的親和素檢測(以3―氨基―9―乙基―卡巴唑為底物，陽性反應產物為紅色)，而標記的探針用堿性磷酸酶標記的抗體來檢測(反應產物為藍色)，兩個檢測系統互相無干擾，所以，標記的親和素抗體也可混合在一起一次孵育。但兩種酶的呈色反應需要的pH條件相同，故呈色反應需分先后兩次進行。
2．雙重熒光標記原位雜交 利用具有不同顏色的熒光素分別標記不同的核酸探針，可檢測同一組織或細胞內兩種不同的靶核酸。用不同的熒光素作標記物進行雙重標記原位雜交，有直接法和間接法兩種。直接法將具有不同顏色的兩種熒光素分別標記兩種不同的核酸探針，用其做原位雜交，雜交信號能在熒光顯微鏡下通過選擇不同的激發濾片而直接觀察。此法操作簡便，但敏感性不高。間接法用生物素分別標記兩種不同的核酸探針，然后用不同熒光素標記的親和素(或抗生物素抗體)抗體來檢測雜交體。間接法比直接法敏感性更高。
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